(переклад основних розділів. З оригінальною статтею, малюнками та переліком літератури можна ознайомитися тут)

Histomorphometric Profile of the Corneal Response
to Short-term Reverse-geometry Orthokeratology
Lens Wear in Primate Corneas
A Pilot Study
Pike-See Cheah, BSc(Hons),*‡ Mohidin Norhani, PhD,† Mohd-Ali Bariah, PhD,†
Maung Myint, MBBS, MMedSci,* Munn Sann Lye, MBBS, MPH, DrPH,§
and Abdul Latiff Azian, MD, PhD*
(Cornea 2008;27:461–470)

Мета: Дослідити пов’язані з короткотривалим застосуванням нічної ортокератології (ОК) гістологічні зміни рогівки примату.

Методи: дев’ять дорослих приматів. Один брав участь як контрольний випадок. Решта вісім носили ОК лінзи зі зворотною геометрією впродовж 4-ох, 8-ми, 16-ти та 24-ох годин з не займаним другим оком для контролю. Виміряні центральна та периферична товщини рогівки, а також ультраструктурні зміни рогівкового епітелію, строми та ендотелію у відповідь на вплив ОК лінз.

Результати: ОК значно зменшило товщину центральної ділянки рогівки в усіх групах, за рахунок змін в епітелії та стромі. Значне стовщення середньо-периферичної ділянки рогівки спостерігалося в групах 16-ти- та 24-охгодинного носіння, і також зумовлене змінами в епітелії та стромі. Гістологічні результати вказують, що у центральній рогівці основним процесом стало стиснення клітин, що призвело до вкорочення криловидних клітин та сплощення базальних клітин більшою мірою, аніж до їх зникнення чи міграції. Перелічені зміни не компрометували структурну цілісність демосом. Клітинні шари стоншеного рогівкового епітелію не змінені. Плоскі клітини мають більшу площу поверхні та овальне ядро замість плоского. Це передбачає відтермінування відшарування старих клітин в стоншеному епітелії середньо-периферичної ділянки. Фізична наявність ОК лінзи не завдавало впливу на ендотелій, мікроструктури мікроворсинок та мікроскладок, розподіл колагену.

Висновки: При короткотривалому застосуванні ОК лінз зі зворотною геометрією рогівка примату зазнає швидких змін у вигляді альтерацій форми епітеліальних клітин. Припускається, що рогівка примату пластична до фізичного впливу ОК лінз.

Ортокератологія [ОК, також відома як рефракційна терапія рогівки (РТР)] – клінічний метод тимчасового зменшення або усунення рефракційної помилки за допомогою зміни форми рогівки жорсткими ОК лінзами зі зворотною геометрією ¹. Декілька досліджень констатують клінічну ефективність ОК, численні топографічні дослідження демонструють спричинене ОК лінзами сплощення рогівки ^2-5.

Перелічені теорії рефракційного впливу ОК розглядають зміну передньої поверхні рогівки (кривизни та товщини) та згинання всієї рогівки (вплив на передню і задню кривизну). Сварбрік та ко. ² припустили, що зміна товщини рогівки супроводжувалась її стоншенням по центру та імовірно потовщенням по периферії. Пізніше, Альхарбі та Сварбрік ³ дійшли до висновку, що нічна ОК призводить до швидкого стоншення епітелію центральної ділянки рогівки та потовщення строми в середній периферії. Наступна зміна сагітальної висоти рогівки і є основним чинником рефракційного ефекту ОК.

Не зважаючи на великі клінічні дослідження, в тому числі вимірювання топографічних змін товщини рогівки, вплив ОК лінз на підлеглі тканини рогівки на мікроскопічному рівні залишається не розглянутим. Зразок людської рогівки отримати неможливо, тож в даному випадку найкращим об’єктом для вивчення є тваринна модель.

Кількість дослідів на тваринах (кролики та коти) ^6,7, що вивчають механізми рогівкових альтерацій, дедалі більшає. Стосовно змін в рогівці, спричинених ОК лінзами, висунуто кілька гіпотез. В тому числі: перерозподіл епітеліальних клітин (загальне зменшення чи збільшення клітинного шару), компресія епітеліальних клітин і рух міжклітинної рідини, зміна проліферації базальних клітин, утримання клітин, альтерація відшарування поверхневих клітин та зміна форми строми ^8,9.

Рогівка примата складається з трьох основних шарів (епітелій, строма та ендотелій) і двох допоміжних (Боуменова мембрана та Десцеметова оболонка). Порівняльні анатомічні дослідження показали, що рогівка примату анатомічно та гістологічно найбільш подібна до людської, особливо за рахунок Боуменової мембрани ^{10, 11}, яка відсутня у деяких ссавців в т.ч. у кроликів ¹². Для цього досліду ми взяли приматів (Macaca fascicularis) замість кроликів, оскільки примати найбільше підходять для вивчення гістологічних змін в рогівці, викликаних ОК лінзами.

Клінічно, часткового зменшення сили заломлення та сплощення центральної ділянки рогівки можна досягнути вже за перші кілька годин застосування ОК лінз ^13-15. В даному дослідженні розглядалися послідовні гістологічні зміни в рогівках приматів, що розвивалися в період короткотривалого використання ОК лінз (з інтервалом носіння у 24 години) на заплющених очах.

Дискусія: Зміни товщини рогівки, спричинені дією лінз зі зворотною геометрією (RGL), у приматів подібні до змін, що спостерігалися при нічному застосуванні ортокератологічних (OK) лінз (із заплющеними очима) у людей. Значні зміни центральної товщини рогівки в цьому дослідженні з’явилися у групи, що носила лінзи по 4 години. Відповідно, в інших групах, що носили лінзи довший час (по 8, 16, 24 години), стоншення центральної частини рогівки також спостерігались. Дані результати свідчать, що застосовані в дослідженні OK лінзи особливого дизайну досягли бажаного ортокератологічного ефекту у приматів, і вони (лінзи) подібні до лінз з клінічних дослідів. Наші дослідження також корелюють з дослідженнями команди Чу та ін. [Choo JD, Caroline PJ, Harlin DD, et al. Morphological changes in cat epithelium following overnight lens wear the Paragon CRT lens for corneal reshaping. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45:1552.], які доповідають про значне центральне стоншення епітелію у котів при застосуванні RGL (із заплющеними очима) для корекції міопії. Так само, дослідження Матсубара та ін. [Matsubara M, Kamei Y, Takeda S, et al. Histological and histochemical changes in rabbit cornea produced by an orthokeratology lens. Eye Contact Lens. 2004;30:198–204.] продемонстрували значне центральне стоншення епітелію у кролів при застосуванні RGL (із заплющеними очима).

Гістологічні дослідження свідчать, що мікроскопічні зміни в рогівці стають помітними за нічного застосування OK лінз із заплющеними очима впродовж як короткого терміну (4 години), так і типового (8 годин) та тривалих (16 та 24 години) термінів. Основна реакція епітелію в центральній ділянці рогівки – радше вогнищеве стиснення клітин (морфологічна зміна), аніж їх міграція чи зникнення шарів клітин. З досліджень контрольних груп, у приматів центральну ділянку рогівки займають 7-8 шарів вишикуваних різних епітеліальних клітин. Стоншення центральної ділянки епітелію досягалось вкороченням периферичних клітин та сплощенням центральних. Аналогічне спостереження було і в дослідженнях Чу та ін. на котах, де за 8 годин користування OK лінзами на заплющених очах центральні клітини ставали круглішими в порівнянні зі звичайною витягнутою формою.

В групах, що носили лінзи по 16 та 24 години, виявлено значне потовщення середньо-периферичної ділянки рогівки. Цей ефект був досягнутий за рахунок змін як в епітелії, так і в стромі (розглянуто нижче). Досліди вказують, що в приматів, на яких застосовувалися OK лінзи по 16 та 24 години, потовщення середньо-периферичної ділянки рогівки (16 годин = +2,4%; 24 години = +3,7%) відбулося за рахунок строми (16 годин = +1,02%; 24 години = +2,4%) та епітелію (16 годин = +16,14%; 24 години = +16,98%). Ділянка потовщення відповідає середньо-периферичній зоні резервуару сльози, створеній крутішою вторинною кривизною RGL. Клінічні дослідження Алхабрі та Сварбріка [Alharbi A, Swarbrick HA. The effects of overnight orthokeratology lens wear on corneal thickness. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:2518–2523.] демонструють середньо-периферичне потовщення строми (2,5%) у 18-ти осіб, що користувалися RGL із заплющеними очима впродовж трьох місяців. Наші результати також корелюють з дослідженнями Чу та ін. на котах. В дослідженнях Матсубара та ін. на кролях, що застосовували RGL по 8 годин щоденно впродовж 28-ми днів, теж помічено збільшення товщини рогівки в середньо-периферичній ділянці.

В потовщеному епітелії базальні клітини мали видовжену форму, зроговілі клітини також збільшили площу поверхні. Чу припускає, що морфологічні зміни базальних клітин можуть бути зумовлені міжклітинним транспортом цитоплазми з центральних клітин до середньо-периферичних. Епітеліальні клітини поєднані між собою містками, що забезпечують міжклітинну комунікацію та молекулярний обмін  [Bergmanson JPG. Light and electron microscopy. In: Efron N, ed. The Cornea: Its Examination in Contact Lens Practice. Oxford: Butterworth-Heinemann; 2001:136–175.]. В цьому дослідженні виявлені стиснуті менші клітини по центру та видовжені клітини по середній периферії. Незважаючи на радикальні морфологічні зміни, вертикально видовжені клітини зберігали порядок вишукування та ідеальний контакт з базальної мембраною. Водночас, в дослідах Мастубари та ін. на кроликах вертикально видовжені клітини середньо-периферичної ділянки рогівки були розташовані не регулярно (OK лінзи носилися щоденно по 8 годин впродовж 21-го дня). Така гістологічна відмінність може бути зумовлена різницею в тривалості застосування OK лінз на рогівках тварин.

Морфологічні зміни у приматів поверхневих зроговілих клітин у зоні потовщеного середньо-периферичного епітелію є цікавою знахідкою. Щодня рогівковий епітелій оновлює поверхневі клітини: зроговілі клітини постійно відлущуються (десквамуються) у ділянці перикорнеальної слізної плівки шляхом апоптозу та замінюються новими клітинами, що проліферують з базальної мембрани. Проліферуючи в зроговілі клітини, стволові клітини базальною мембрани постійно сплющуються і збільшують площу поверхні [Gipson IK. Anatomy of the conjunctiva, cornea, and limbus. In: Smolin G,Thoft R, eds. The Cornea: Scientific Foundations and Clinical Practice. Boston: Little, Brown & Company; 1994:3–24.]. Попередні дослідження припускали, що більша площа поверхні поверхневих клітин у носіїв контактних лінз зумовлена відтермінованим відлущуванням [Lemp MA, Gold JB. The effects of extended-wear hydrophilic contact lenses on the human corneal epithelium. Ophthalmology. 1986;101:274–277.], [Lemp MA, Mathers WD, Sachdev MS. The effects of contact lens wear on the morphology of corneal surface cells in the human. Trans Am Ophthalmol Soc. 1990;88:313–325.] З цього дослідження, зроговілі клітини середньо-периферичного потовщеного епітелію були більшого розміру та мали ядра овальної форми, або більші за ядра звичайних зроговілих клітин. Наявність цих більших старших поверхневих епітеліальних клітин доказує затримку процесу десквамації. Ми вважаємо, що затримка відлущування зроговілого епітелію сприяє подальшому його росту та збільшенню площі поверхні. Накопичення сльози під крутішою вторинною чи зворотною кривизною OK лінзи може змінювати мікросередовище під лінзою і тим самим затримувати відлущування клітин у сльозу. Для точного визначення частоти десквамації в потовщеному епітелію (клітини за хвилину) необхідні подальші дослідження.

Дослідження продемонстрували, що рогівка почала помітно сплющуватись вже після першої ночі застосування OK лінз. Отже, рогівка дуже пластична до їх дії. Такі миттєві зміни були спричинені тиском лінзи та повіки, нічним набряком рогівки. Це стоншення може призводити до порушення цілісності епітеліального бар’єру, що є основним захистом від патогенетичних чинників зі сльози. Тож, дослідженню підлягали також стабілізуючі структури епітелію – десмосоми (елементи міжклітинної адгезії) [Bron AJ, Tripathi RC, Tripathi BJ. Wolff’s Anatomy of the Eye and Orbit. London: Chapman & Hall; 1997]. Чу та ін. [Choo JD, Caroline JD, Harlin DD. How does the cornea change under corneal reshaping contact lens? Eye Contact Lens. 2004;30:211–213.] припустили, що направлена сила (спереду – сльоза та лінза, ззаду – строма) може руйнувати міжклітинні містки і тим самим сприяти пересуванню епітелію. Даний дефект зумовлює зміну положення клітин або навіть міграцію епітелію. Наші досліди довели, що навіть під час тривалих і суттєвих змін форми епітелію рогівки кількість та якість десмосом залишається нормальною. Отже, десмосоми рогівкового епітелію виявляються гнучкими та еластичними і мають дуже тривку структуру. Таким чином, еластичність десмосом дозволяє сплющувати криловидні та базальні клітини без порушення їх структури.

Епітеліальні клітини вкриті глікокаліксом – волокнистою мантією, сформованою клітинними утвореннями: мікроворсинками та мікроскладками епітелію [Gipson IK, Joyce NC. Anatomy and cell biology of the cornea, superficial limbus and conjunctiva. In: Albert DM, Jakobiec FA, Azar DT, et al., eds. Principles and Practice of Ophthalmology. Philadelphia: WB Saunders; 2000:612–629.]. Мікроворсинки та мікроскладки також створюють систему підтримки сталого складу сльози та слизу, що захищають рогівку. Комплекс клітинних утворень, глікокаліксу, сльози та слизу утворюють потужний бар’єр на шляху інфекції ока. Долман [Dohlman CH. The function of the corneal epithelium in health and disease. Invest Ophthalmol. 1971;10:383–407.] припустив, що мікроворсинки та мікроскладки також приймають участь у фіксації сльози на оці всупереч гравітаційним силам. На відміну від звичайних лінз, RGL чинять тиск на рогівку через слізну плівку. Тож, важливо вивчити зміни поверхневих структур епітелію у відповідь на цей тиск. З досліджень виходить, що OK лінзи своїм впливом на поверхню рогівки не порушують цілісність цих поверхневих структур. Безсумнівно, питання впливу OK лінз на клітинні утворення епітелію потребує подальших досліджень методом дзеркальної мікроскопії.

Дослідження продемонстрували, що центральне стоншення рогівки супроводжується стоншенням строми в усіх групах, і додатково потовщенням середньо-периферичної строми в групах, що носили лінзи по 16 та 24 години. З цього випливає, що за одну ніч OK лінзи можуть вплинути на тиск слізної плівки і тим самим призвести до змін в стромі. Розглянуті RGL мають плоскішу центральну оптичну зону 6,0-6,5 мм в діаметрі, оточену крутою другою кривизною (зворотна кривизна).  Периферична частина лінзи забезпечує краще прилягання до середньо-периферичної та периферичної ділянок рогівки. Цей дизайн допомагає зберігати центральне положення лінзи та забезпечує різний тиск слізної плівки в різних ділянках лінзи. RGL чинить позитивний тиск на рогівку в центральній плоскій ділянці, а друга кривизна спричинює від’ємний тиск в середньо-периферичній зоні та відтягує на себе сльозу. Сльоза розподіляється неоднаково і чинить різний тиск на рогівку, чим може бути зумовлений ефект «складання» центральної ділянки рогівки і стоншення центральної строми. Тим не менше, електронна мікроскопія показала, що колагенові волокна розповсюджені рівномірно в усіх досліджених рогівках та в передній і задній частинах строми. Водночас, в запаленій стромі волокна колагену знаходились не в однакових кількостях в колагенових ламелах та інтраламелярних озерах аморфної рідини (з досліджень Едельхаусера та ін. [ Edelhauser HF, Geroski DH, Ubels JL. Physiology. In: Smolin G, Thoft R, eds. The Cornea: Scientific Foundations and Clinical Practice. Boston: Little, Brown & Company; 1994:25–46]). Отже, короткотривале застосування OK лінз не спричинює запалення рогівки. Але питання кінцевого механізму стоншення та потовщення строми в цьому дослідженні залишається не вирішеним.

Рогівковий ендотелій – це розташований на задній поверхні рогівки моношар плоских спеціалізованих клітин, багатих на мітохондрії [Iwamoto T, Smelser GK. Electron microscopy of the human corneal endothelium with reference to transport mechanisms. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1965;4:270–284.]. Цей шар забезпечує стан легкої дегідратації рогівки регулюючи транспорт рідин та солей через її задню поверхню крізь щільні (zonulae occludentes) та проміжні зв’язки.  Щільні зв’язки, розташовані на кінцевих ділянках латеральних мембран клітин, зв’язуючи та виповнюючи міжклітинний простір [McLaughlin BJ, Caldwell RB, Sasaki Y, et al. Freeze-fracture quantitative comparison of rab], [Hirsch M, Renard G, Faure JP, et al. Study of the ultrastructure of the rabbit corneal endothelium by the freeze-fracture technique: apical and lateral junctions. Exp Eye Res. 1977;25:277–288.]. Однак, ці зв’язки не оточують клітини повністю, тож рідина з передньої камери ока може потрапляти у відносно дегітратовану рогівку. Проміжні зв’язки знаходяться по всій поверхні латеральної плазми та мають специфічну пентиламінарну структуру. Вони звужують ділянки міжклітинного простору з 25-45 до 3 нм [Leuneberger PM. Lanthanum hydroxide tracer studies on rat corneal endothelium. Exp Eye Res. 1973;15:85–91], [Kreutziger GO. Lateral membrane morphology and gap junction structure in rabbit corneal endothelium. Exp Eye Res. 1976;23:385–393]. Звужені міжклітинні проміжки спрямовують рідинний струм до сполучених латеральних мембран і, тим самим, запобігають надмірній циркуляції рідини в ендотелії та набряку строми.

У даному дослідженні примати носили RGL з високим Dk із заплющеними очима. Плоскі жорсткі контактні лінзи чинять OK ефект, механічно тиснучи на центральну ділянку рогівки. Таке вторгнення може мати негативний ефект на метаболізм рогівки та зашкодити цілісності ендотелію, що призведе до швидкого набряку рогівки. Електронна мікроскопія виявила структури рогівкового ендотелію, в тому числі компоненти міжклітинних зв’язків (zonulae occludens, zonulae adherens та проміжні зв’язки), в гарному стані. Щільні зв’язки зберегли свої розміри та кількість. Проміжні зв’язки також знайдені на всіх рівнях з’єднаних латеральних мембран. Між сусідніми ендотеліальними клітинами спостерігалися як звичайні, так і звужені ділянки міжклітинного простору. Дані знахідки дозволяють зробити припущення, що короткотривале нічне застосування ОК лінз не впливає на міжклітинні зв’язки ендотелію та не порушують водопроникний бар’єр рогівки. Ці результати спостережень збігаються з результатами роботи Хіраоки та ін. [Hiraoka T, Furuya A, Matsumoto Y, et al. Influence of overnight orthokeratology on corneal endothelium. Cornea. 2004;23(Suppl 1):S82–S86.], яка демонструє відсутність впливу річного використання RGL з високим Dk на кількість, розмір та форму ендотеліальних клітин рогівки. Це може бути зумовлено високою кисневою проникністю застосованих лінз.

У заключенні, дослідження показало, що короткотривале застосування RGL чинить стрімкі та значні гістомофрометричні зміни в рогівці приматів. Зокрема, в рогівковому епітелії відбуваються швидкі альтерації. Спостерігалося вкорочення базальних та криловидних клітин, що призводило до тотального сплощення центрального епітелію. Також виявлено потовщення середньо-периферичної ділянки рогівки, що супроводжувалося збільшенням розміру поверхневих клітин. Такі результати дозволяють зробити припущення, що рогівковий епітелій легко піддається фізичному впливу ОК лінз та альтерує на мікроскопічному рівні. Ці короткотривалі досліди на приматах корелюють з результатами використання ОК лінз людьми. Однак, товщина рогівки може значно змінюватись в процесі її підготовки до мікроскопії, особливо на етапі висічення, що значно обмежує результативність такої мікроскопії.